Nhuộm soi vi khuẩn - xét nghiệm cơ bản trong xác định vi khuẩn gây bệnh

Có rất nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cho cơ thể, tuy nhiên các triệu chứng của các bệnh do vi khuẩn gây ra đều gần như giống nhau. Để phân biệt được bệnh do vi khuẩn nào gây ra thì phương pháp nuôi cấy và định danh vi khuẩn là phương pháp giúp chẩn đoán chính xác vi khuẩn gây bệnh. Và trước khi tiến hành nuôi cấy thì nhuộm soi vi khuẩn là kỹ thuật đầu tiên phải làm để có định hướng đầu tiên về loại vi khuẩn.

1. Nhuộm soi vi khuẩn để làm gì?

Thực hiện kỹ thuật nhuộm soi vi khuẩn với mục đích đánh giá sơ bộ về hình ảnh, tính chất bắt màu, cách sắp xếp của vi khuẩn và hình thái tế bào từ bệnh phẩm. Từ đó có định hướng sơ bộ về vi khuẩn để chọn phương pháp tiếp theo nhằm định danh vi khuẩn gây bệnh.

2. Nguyên lý của phương pháp nhuộm soi vi khuẩn

Tùy theo triệu chứng của bệnh nhân có thể mắc loại vi khuẩn nào mà bác sĩ sẽ lựa chọn phương pháp nhuộm thích hợp, bởi vì các loại vi khuẩn có tính chất bắt màu với các thuốc nhuộm khác nhau là khác nhau.

Có nhiều phương pháp nhuộm như: nhuộm Gram, nhuộm xanh methylen, nhuộm Ziehl - Neelsen, nhuộm thấm bạc,... Có 3 phương pháp nhuộm thường được sử dụng nhiều nhất là:

Nhuộm Gram: Phương pháp này dựa trên sự khác nhau về cấu tạo vách tế bào vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Trong quá trình nhuộm, vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím của thuốc nhuộm tím gentian, còn vi khuẩn Gram âm không giữ được màu tím của gentian và sẽ bắt màu hồng fuchsin. Khi soi trên kính hiển vi với vật kính lớn giúp nhận định về hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn.

Hình 1: Mẫu tiêu bản nhuộm Gram

Nhuộm xanh methylen: Thuốc nhuộm xanh Methylen là thuốc nhuộm cation mang điện tích dương, màng tế bào của vi khuẩn mang điện tích âm. Vì vậy khi cho thuốc nhuộm gây ra hiện tượng bắt màu do sự kết hợp của hai loại điện tích trái dấu. 

Đây là phương pháp nhuộm đơn giản để quan sát hình dạng của tế bào, vi khuẩn, được sử dụng trong phản ứng phình vỏ, định danh Corynebacterium diphtheriae.

Nhuộm Ziehl - Neelsen: Phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen sử dụng 2 hoá chất nhuộm màu là carbol fuchsin và xanh methylen kết hợp với chất tẩy màu (hỗn hợp acid-alcohol) để phát hiện các trực khuẩn kháng cồn kháng acid (thường gặp là Mycobacteria hay còn gọi là trực khuẩn lao). 

Vách tế bào các Mycobacteria có một lượng lớn acid mycolic nên khi sử dụng phương pháp nhuộm Gram truyền thống nên các vi khuẩn này rất khó bắt màu. Do đó, phải sử dụng phương pháp nhuộm kháng cồn kháng acid để quan sát các vi khuẩn này.

Hình 2: Mẫu tiêu bản nhuộm Ziehl - Neelsen

3. Các bước thực hiện quy trình nhuộm soi vi khuẩn

3.1. Lấy bệnh phẩm

Bệnh phẩm được lấy tại các vị trí nghi ngờ nhiễm khuẩn của cơ thể. Do đó mỗi loại bệnh phẩm khác nhau có các phương pháp lấy khác nhau. 

Lấy bệnh phẩm đúng cách là yếu tố rất quan trọng để xác định cơ thể có bị nhiễm vi khuẩn hay không. Nếu lấy sai bệnh phẩm (sai vị trí, lấy bệnh phẩm không đặc hiệu,...) thì các bước tiếp theo đều không có tác dụng.

Nguyên tắc lấy bệnh phẩm trong các xét nghiệm vi khuẩn là:

• Đúng chỗ: Chọn những vị trí đặc hiệu nhất nghi ngờ có nhiều vi khuẩn nhất.

• Đúng thời điểm: Chọn thời điểm lấy bệnh phẩm phù hợp cũng có ảnh hưởng đến lượng vi khuẩn trong bệnh phẩm khi lấy (ví dụ đối với máu thường lấy lúc người bệnh đang lên cơn sốt. Hoặc lấy bệnh phẩm trước khi người bệnh dùng kháng sinh hoặc lấy sau khi dùng kháng sinh 24h,...).

• Nguyên tắc quan trọng nhất chính là vô khuẩn vì vi khuẩn tồn tại khắp nơi ngoài môi trường, nếu như quá trình lấy mẫu không đáp ứng vô khuẩn thì khi tiến hành xét nghiệm có thể sẽ cho kết quả nhầm loại vi khuẩn nhiễm từ môi trường.

Vi khuẩn thường có đời sống rất ngắn ngoài môi trường vì vậy sau khi lấy mẫu xong phải chuyển ngay về phòng xét nghiệm để tiến hành nhuộm soi. Nếu trong điều kiện không chuyển được ngay về phòng xét nghiệm thì phải bảo quản ở môi trường và nhiệt độ thích hợp.

3.2. Các bước tiến hành

Phòng xét nghiệm vi sinh sau khi tiếp nhận bệnh phẩm sẽ đối chiếu thông tin trên mẫu bệnh phẩm và giấy xét nghiệm sau đó sẽ tiến hành làm tiêu bản nhuộm soi phù hợp với mỗi loại bệnh phẩm.

Tùy theo sự nghi ngờ của bác sĩ với từng loại vi khuẩn cần xác định để tiến hành chọn phương pháp nhuộm và thuốc nhuộm thích hợp. 

Tiến hành các bước nhuộm tiêu bản theo quy trình chuẩn của phương pháp nhuộm đó.

Sau khi nhuộm xong, để tiêu bản khô tự nhiên hoặc thấm khô bằng giấy thấm rồi tiến hành soi trên kính hiển vi quang học.

Hình 3: Nhuộm tiêu bản

3.3. Trả kết quả xét nghiệm

Quan sát tiêu bản ở vật kính x10, x40 nhằm mục đích:

• Đánh giá tiêu bản đã được tẩy màu đúng chưa.

• Tùy theo mẫu bệnh phẩm mà màu nền của tiêu bản có hay không bắt màu.

• Nếu quan sát thấy hình ảnh tế bào, xác định số lượng tế bào của bạch cầu đa nhân và tế bào biểu mô trong 20 - 40 vi trường.

Chuyển sang quan sát ở vật kính dầu x100 quan sát hình ảnh tế bào và vi khuẩn.

• Hình thể: cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn, phẩy khuẩn, song cầu,...

• Kích thước: to/nhỏ, đồng đều/đa hình thái,...

• Tính chất bắt màu: tùy theo phương pháp nhuộm để đánh giá tính chất bắt màu của vi khuẩn: Gram âm (bắt màu đỏ), Gram dương (bắt màu tím), bắt màu xanh (xanh methylen) hay bắt màu hồng (nhuộm ziehl - Neelsen),...

• Cách sắp xếp: đứng đơn lẻ, xếp theo cặp, xếp theo chuỗi, xếp theo đám,...

• Xem xét vị trí của vi khuẩn ở trong hay ngoài bạch cầu.

• Đếm số lượng và mô ta các loại vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản.

Hình 4: Tiêu bản có song cầu bắt màu Gram âm

Trả kết quả nhuộm soi vi khuẩn:

• Âm tính: Không tìm thấy vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm.

• Dương tính: Ghi rõ các tế bào và số lượng tế bào quan sát được trong ít nhất 20 vi trường

Đối với với vi khuẩn cần nêu rõ hình thái, cách sắp xếp, tính chất bắt màu và số lượng vi khuẩn theo tiêu chuẩn của phòng xét nghiệm.

Đối với xét nghiệm nhuộm soi vi khuẩn thì việc lấy đúng bệnh phẩm quan trọng nhưng việc làm tiêu bản nhuộm cũng quan trọng không kém. Tiêu bản yêu cầu phải có độ dày vừa phải, không có cặn thuốc nhuộm nếu không có thể sẽ bị nhầm lẫn vi khuẩn với cặn thuốc nhuộm.

Xét nghiệm nhuộm soi vi khuẩn cần phải được thực hiện trong môi trường vô trùng tuyệt đối vì vậy việc chọn đơn vị để thực hiện phương pháp này là một điều vô cùng quan trọng.

Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC với trung tâm xét nghiệm được đầu tư trang thiết bị hiện đại chuẩn quốc tế đã được bộ y tế công nhận đủ điều kiện tiến hành phương pháp nhuộm soi vi khuẩn là một đơn vị bạn nên tin tưởng lựa chọn.

Gọi đến tổng đài 1900 56 56 56 để được tư vấn về các dịch vụ xét nghiệm và nhiều tiện ích khác.