HBV cccDNA: sự dai dẳng của nó trong nhân tế bào gan bị nhiễm là một thách thức đối với sự điều trị khỏi chức năng nhiễm HBV mạn

Nhiễm virus viêm gan B (HBV) là một gánh nặng lớn đối với sức khỏe cộng đồng. Góp phần vào mục tiêu loại trừ viêm gan virus vào năm 2030 của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), PGS.TS Nguyễn Nghiêm Luật đã có bài viết trình bày về cấu trúc phân tử, sự hình thành, vai trò chức năng, các đích tác động của các thuốc kháng HBV cccDNA mới và các thách thức đối với sự điều trị khỏi chức năng HBV.

PGS TS Nguyễn Nghiêm Luật

Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC

1) Vòng đời của HBV bao gồm các bước: (1) Sự xâm nhập của virus vào tế bào vật chủ; (2) vận chuyển rcDNA vào nhân; (3) rcDNA chuyển đổi để hình thành cccDNA; (4) cccDNA phiên mã để tổng hợp các mRNA của virus; (5) các mRNA dịch mã để tổng hợp protein của virus; (6) lắp ráp pgRNA thành lõi nhân; (7) pgRNA phiên mã ngược để tổng hợp DNA sợi âm, rồi DNA sợi dương và sau đó là rcDNA lõi; (8a) rcDNA lõi quay vòng trở lại nhân để tạo cccDNA và DNA tích hợp; và (8b) rcDNA lõi được bọc bởi các HBsAg thành các hạt virus hoàn chỉnh và được giải phóng khỏi tế bào gan.

2) Sự sinh tổng hợp cccDNA là một quá trình nhiều bước gồm: (1) Loại bỏ HBV polymerase (POL) khỏi rcDNA bằng: tyrosylphosphodiesterase (TDP), như TDP2; các nuclease, như FEN-1; các protease; và các cơ chế khác còn chưa được rõ. (2) Chuỗi âm được sửa chữa thêm bằng cách loại bỏ đoạn DNA thừa ở đầu nhờ FEN-1 hoặc các nuclease khác và nối lại nhờ LIG1 hoặc LIG3. Chuỗi dương được sửa chữa thêm bằng cách: hoàn thành quá trình tổng hợp DNA nhờ các DNA polymerase khác nhau của vật chủ; loại bỏ và thay thế đoạn mồi RNA nhờ FEN-1; và nối lại nhờ LIG1 và LIG3; (3) cccDNA sau đó được nhiễm sắc thể bởi các protein histone và phi histone của tế bào và chuyển thành một nhiễm sắc thể nhỏ.

3) Các vai trò chức năng của cccDNA gồm: (1) CccDNA tác động như một khuôn mẫu để phiên mã tất cả các RNA của virus, bao gồm cả pgRNA, đóng vai trò chính trong vòng đời của virus; (2) sự khuếch đại của cccDNA xảy ra trong quá trình quay vòng nội bào có thể đóng một vai trò trong giai đoạn đầu của nhiễm HBV; (3) pgRNA được tạo ra từ cccDNA cũng có thể được phiên mã ngược để tạo thành rcDNA để nhân bản virus; (4) cccDNA cũng đóng một vai trò trong việc nhiễm HBV dai dẳng hoặc tái phát viêm gan vì cccDNA rất ổn định trong tế bào gan; (5) sự dai dẳng của HBV cccDNA cũng đóng một vai trò trong nhiễm HBV ẩn (OBI).

4) Các thuốc điều trị mới đối với cccDNA của HBV gồm các thuốc: (1) Loại bỏ cccDNA bằng cách chỉnh sửa gen; (2) ngăn chặn sự tích lũy cccDNA bằng cách khóa các yếu tố vật chủ liên quan đến sự hình thành cccDNA; (3) làm im lặng sự phiên mã cccDNA bằng cách nhắm đích vào các yếu tố điều hòa biểu sinh; (4) điều biến sự lắp ráp lõi nhân bằng cách ngăn chặn quay vòng lại của lõi nhân mới được tổng hợp, ngăn chặn sự hình thành cccDNA và cả HBc cấu trúc của cccDNA; (5) đào thải qua trung gian miễn dịch các tế bào gan chứa cccDNA hoặc có biểu hiện của cccDNA.

5) Những thách thức đối với việc chữa khỏi chức năng viêm gan B mạn gồm: (1) Sự dai dẳng của cccDNA, không chịu tác động bởi các thuốc hiện tại, là thách thức lớn để đạt được việc chữa khỏi HBV; (2) sự hiểu biết về sinh học cơ bản của cccDNA để phát triển các loại thuốc loại bỏ cccDNA còn chưa đầy đủ; (3) các loại thuốc mới nhằm loại bỏ hoặc làm im lặng cccDNA hiện đang trong còn đang thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I hoặc II; (4) hiệu quả của thuốc kháng cccDNA mới chưa được đánh giá đầy đủ; và (5) các xét nghiệm về cccDNA hiện chưa đủ độ nhạy và tiêu chuẩn hóa để có thể giúp hướng dẫn điều trị nhằm loại bỏ cccDNA.                                                                      

***

HBV cccDNA: its persistence in the nucleus of infected hepatocytes is the major challenge to a functional cure for chronic hepatitis B

Luat Nghiem Nguyen

MEDLATEC General Hospital

Abstract

1) The HBV life cycle includes steps: (1) Virus entry into the host cell; (2) trafficking of rcDNA to the nucleus; (3) conversion of rcDNA to cccDNA; (4) transcription to synthesize viral RNAs; (5) translation to synthesize viral proteins; (6) assembly of the pgRNA; (7) Reverse transcription of pgRNA to synthesize the minus strand DNA, the plus strand DNA and then rcDNA; (8a) nuclear recycling of capsids containing rcDNA to form cccDNA and DNA integration; and (8b) envelopment of the rcDNA-containing capsid and secretion of complete virions.

2) The cccDNA biogenesis is a multi-step process includes: (1) Removal of HBV polymerase (POL) from rcDNA by: tyrosylphosphodiesterases (TDPs), such as TDP2; nucleases, such as FEN-1; proteases; and other mechanisms are not clear. (2) The minus strand is further repaired by removal of the terminal redundancy DNA flap via FEN-1 or other nucleases and ligation of the nick by LIG1 or LIG3. The plus strand is further repaired by: completion of DNA synthesis by various host DNA polymerases; removal of the displaced RNA primer via FEN-1; and ligation of the nick by LIG1 and LIG3, (3) cccDNA is then chromatinized by cellular histone and nonhistone proteins and converted into a minichromosome.

3) Functional roles of cccDNA include: (1) CccDNA acts as a template for the transcription of all viral RNAs, including pgRNAs, plays a key role in the life cycle of the virus; (2) the amplification of cccDNA occurs during intracellular recycling may plays a role in the early phases of HBV infection; (3) The pgRNA generated from cccDNA may also be reverse transcribed to form rcDNA for viral replication; (4) cccDNA is also play a role in persistent HBV infection or hepatitis relapse since cccDNA is very stable in hepatocytes; (5) the persistence of HBV cccDNA also play a role in occult HBV infection (OBI).

4) Novel drugs for eliminating the cccDNA of HBV include: (1) Elimination of cccDNA by gene editing; (2) prevention of cccDNA accumulation by blocking host factors involved in cccDNA formation, (3) silencing of cccDNA transcription by targeting epigenetic regulation; (4) nucleocapsid assembly modulators by preventing reimport of newly synthetized nucleocapsid, preventing formation of cccDNA and maybe playing a role in the cccDNA structure itself; and (5) immune-mediated clearance of the cccDNA or cccDNA expressing hepatocytes.

5) The challenges to a functional cure for chronic hepatitis B include: (1) The persistence of the cccDNA minichromosome, which is unaffected by current therapies, is the major challenge to achieving an HBV cure; (2) the understanding of the basic biology of cccDNA for the development of drugs that remove cccDNA is incomplete; (3) new drugs aimed at removing or silencing cccDNA currently are in phase I or II clinical trials; (4) the effectiveness of new anti-cccDNA drugs has not been fully evaluated; and (5) tests for cccDNA are not sufficiently sensitive and standardized to help guide treatment for cccDNA removal.

***

           Nhiễm virus viêm gan B (HBV) vẫn là một gánh nặng lớn đối với sức khỏe cộng đồng. WHO ước tính có 257 triệu người nhiễm HBV trên thế giới (chiếm khoảng 3,5% dân số thế giới), gây ra hơn 887.000 ca tử vong do xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) vào năm 2019 [16].

            HBV là một loại virus DNA gây nhiễm ở tế bào gan, có DNA bộ gen vòng tròn 3,2 kb, sợi đôi giãn một phần (relaxed-circular partially double-stranded DNA: rcDNA). Sau khi xâm nhập vào tế bào gan, rcDNA bộ gen của HBV được giải phóng khỏi lõi nhân và xâm nhập vào nhân của tế bào gan. Trong nhân, rcDNA được bộ máy sửa chữa DNA của tế bào chủ biến đổi để tạo ra DNA vòng khép kín cộng hóa trị (covalently closed circular DNA: cccDNA), một DNA bộ gen dưới dạng một nhiễm sắc thể nhỏ tồn tại bền vững trong nhân tế bào gan và có khả năng mã hóa các RNA như pgRNA và các mRNA của các protein của HBV như các protein bề mặt, protein lõi, các polymerase và protein X, làm cho HBV không ngừng nhân lên [15].

           Sự tồn tại của cccDNA trong các tế bào gan bị nhiễm bệnh là một thách thức lớn đối với các thuốc kháng virus hiện nay. Hai nhóm thuốc kháng virus đã được FDA chấp thuận để điều trị nhiễm HBV mạn là interferon-alpha (IFN-α) và các thuốc tương tự nucleos(t)ide (NAs). IFN-α là thuốc điều biến miễn dịch nhưng có tỷ lệ đáp ứng thấp và có khá nhiều tác dụng phụ. Các thuốc tương tự nucleos(t)ide (NAs) có khả năng ức chế sự phiên mã ngược của virus để hạn chế sự nhân lên của virus, nhưng hầu như không có tác dụng đối với cccDNA nên không thể loại bỏ được sự nhân lên và tái phát của virus sau khi ngừng điều trị. Do đó, nhu cầu cấp thiết hiện nay là cần phát triển các thuốc kháng virus mới có khả năng chữa khỏi chức năng (functional cure) nhiễm HBV mạn, nghĩa là phải đạt được sự mất HBsAg và DNA HBV dưới ngưỡng phát hiện sau khi ngừng điều trị ít nhất 6 tháng [16].

           Hiện nay, việc phát triển các thuốc kháng HBV mới hiện đang được thực hiện. Các thuốc kháng HBV mới gồm các thuốc nhắm đích vào các đích phân tử trong vòng đời (life cycle) của HBV, trong đó HBV cccDNA là một đích quan trọng nhất và các thuốc điều hòa miễn dịch của vật chủ. Đến nay, trong các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I và II, các thuốc mới này cho thấy có khả năng ức chế HBV cccDNA và làm giảm HBsAg ở các mức độ khác nhau [8, 10, 12].

            Để góp phần vào mục tiêu loại trừ viêm gan virus vào năm 2030 của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), trong bài tổng quan này, cấu trúc phân tử, sự hình thành, vai trò chức năng, các đích tác động của các thuốc kháng HBV cccDNA mới và các thách thức đối với sự điều trị khỏi chức năng HBV sẽ được trình bày.

1. Vòng đời của HBV và cấu trúc phân tử của HBV cccDNA

        1.1. Chu kỳ sống của HBV.

        Chu trình sống (life cycle) của virus viêm gan B là một quá trình phức tạp (multi-step process), gồm các bước sau:

       1) HBV bám và xâm nhập vào tế bào gan của vật chủ bằng cách liên kết với thụ thể của polypeptide đồng vận chuyển natri taurocholate (sodium taurocholate co-transporting polypeptide receptor: NTCP receptor).

       2) Vận chuyển DNA vòng giãn (relaxed circular DNA: rcDNA) từ bào tương vào nhân tế bào. HBV được loại bỏ lớp vỏ và lõi để lộ ra bộ gen rcDNA của virus, bộ gen rcDNA được di chuyển vào nhân tế bào gan.

       3) DNA vòng giãn (rcDNA) được biến đổi để hình thành cccDNA (covalently closed circular DNA) giúp virus nhân bản hoặc tạo thành DNA sợi kép thẳng (double-stranded linear DNA: dslDNA) giúp virus tích hợp vào bộ gen của nhân tế bào gan dưới dạng các DNA tích hợp (DNA integration) của HBV.

       4) CccDNA phiên mã (transcription) để tổng hợp các RNA thông tin (mRNAs) của virus như: (1) RNA tiền gen (pcRNA) là RNA thông tin có khả năng giúp virus không ngừng nhân lên; mRNA tiền lõi (PC mRNA); C mRNA giúp tổng hợp cả protein lõi (core protein) và enzyme polymerase phiên mã ngược (reverse transcriptase); các L, M và S mRNA giúp tổng hợp các protein bề mặt lớn, trung bình và nhỏ (L, M and S envelope proteins); và X mRNA giúp tổng hợp protein X, một protein tham gia vào sự điều hòa phiên mã.

       5) Dịch mã (translation) là quá trình các mRNA tổng hợp các protein tương ứng của virus có các vai trò khác nhau.

       7) Phiên mã ngược (reverse transcription). RNA tiền gen (pgRNA) trong lõi nhân tổng hợp DNA sợi đơn âm (minus-strand single DNA: minus-ssDNA), DNA sợi đơn dương (plus-strand single DNA) và sau đó hình thành DNA giãn một phần (rcDNA).

      8a) Khoảng 10% các lõi chứa rcDNA (nucleocapsid) quay vòng trở lại nhân (nuclear recycling) tế bào gan để tạo thành nhiều cccDNA hơn (sự khuếch đại cccDNA nội bào) hoặc tạo thành DNA sợi kép thẳng (double-stranded linear DNA: dslDNA) để tích hợp vào DNA của nhân tế bào gan dưới dạng các DNA tích hợp (DNA integration).

      8b) Khoảng 90% các lõi chứa rcDNA (nucleocapsid) được bao bọc bằng các protein vỏ tạo thành các hạt virus hoàn chỉnh (virions), hoặc tạo thành các hạt virion rỗng hình cầu hoặc hình sợi chỉ chứa HBsAg để được giải phóng ra khỏi tế bào gan [6, 11] (Hình 1).

Hình 1. Chu kỳ sống của HBV (Lok ASF, 2018 [11])

           Sự hiểu biết về vòng đời của HBV có thể giúp các ý tưởng mới để tìm kiếm các đích kháng virus tiềm năng để tìm ra các loại thuốc mới và các dấu hiệu virus mới để theo dõi hiệu quả của điều trị kháng virus ở bệnh nhân viêm gan B mạn trong tương lai.

       1.2. Cấu trúc phân tử của HBV cccDNA.

            HBV là một trong những loại virus nhỏ nhất và có bộ gen DNA nhỏ 3,2 kb, hình tròn, có khả năng mã hóa hạn chế. Bộ gen của HBV được sắp xếp thành bốn khung đọc mở (open reading frames: ORF) chồng chéo một phần. Bộ gen có khả năng phiên mã thành RNA tiền gen (pregenomic RNA: pgRNA). Các khung đọc mở có khả năng mã hóa cho các RNA thông tin (mRNA) của bốn protein chính gồm: (1) polymerase (POL), liên quan đến quá trình phiên mã; (2) ba protein bề mặt (surface: HBs), là các kháng nguyên bề mặt nhỏ (small), trung bình (medium) và lớn (large) tạo nên lớp vỏ và làm trung gian cho sự xâm nhập của virus; (3) protein lõi (core) của HBV (HBc), tạo nên lõi (capsid), cần thiết cho quá trình nhân lên của virus và đóng gói bộ gen dưới dạng lõi nhân (nucleocapsid) và một số protein liên quan đến lõi, như kháng nguyên e (HBV e antigen: HBe) và protein tiền lõi (pre-core protein); và (4) protein X (HBx), với nhiều chức năng khác nhau [15].

            Khi xâm nhập HBV vào tế bào chất của tế bào gan, bộ gen giãn một phần (relaxed circular DNA: rcDNA) được vận chuyển vào nhân và chuyển đổi thành cccDNA (covalently closed circular DNA), đóng vai trò làm khuôn mẫu (template) cho quá trình phiên mã thành các mRNA của virus. Về cấu trúc, bộ gen cccDNA gồm hai chuỗi hoàn chỉnh (complete strands) là chuỗi âm ở phía ngoài và chuỗi dương ở phía trong, với hai lần lặp lại trực tiếp (direct repeats: DRs) tại các nucleotide thứ 1826 và 1592 và tại vị trí ban đầu là vị trí EcoRI, trong khi bộ gen rcDNA có một chuỗi âm hoàn chỉnh có một đoạn dư thừa đầu tận với 9 nucleotide và một đoạn nucleotide mã hóa cho polymerase (POL) đầu tận gắn vào đầu 5′ và một chuỗi dương có đầu 5′ được xác định với đoạn mồi RNA có đầu 3′ biến đổi. Phân tử cccDNA tạo thành được tồn tại dưới dạng một nhiễm sắc thể nhỏ (minichromosome) bền vững trong nhân của các tế bào gan bị nhiễm HBV. Sự khác nhau về cấu trúc của cccDNA so với bộ gen giãn một phần (rcDNA) của HBV được thể hiện ở Hình 2.

Hình 2. Cấu trúc phân tử khép kín của bộ gen của cccDNA so với bộ gen giãn một phần (rcDNA) của HBV (Li X, 2017 [9]): (a) cccDNA gồm hai chuỗi đầy đủ (complete strands) là chuỗi âm ở phía ngoài và chuỗi dương ở phía trong, có hai chỗ lặp lại trực tiếp (two direct repeats: DRs) tại các nucleotide (nt) 1826 và 1592 và tại vị trí ban đầu là vị trí EcoRI; (b) rcDNA có một chuỗi âm đầy đủ, ở đầu tận 5' có thừa 9 nucleotide (đường màu xanh lá cây) và một nucleotide protein polymerase (hình bầu dục màu xanh lam), còn chuỗi dương ở phía trong cũng có hai chỗ lặp lại trực tiếp (DRs) tại các nucleotide (nt) 1826 và 1592 nhưng có đầu 5′ gắn với một đoạn mồi RNA (đường màu đỏ) và có một đoạn biến đổi ở đầu 3′ (đường đứt nét).

2. Cơ chế hình thành của cccDNA trong nhân tế bào gan

            Sự hình thành cccDNA của HBV từ rcDNA trong nhân các tế bào gan bị nhiễm HBV là một quá trình nhiều bước (multistep process) gồm các bước:

        1) Loại bỏ HBV polymerase (POL) khỏi chuỗi âm của rcDNA bằng: (1) các tyrosylphosphodiesterase (TDP), chẳng hạn như TDP2; (2) các nuclease, chẳng hạn như nuclease FEN-1; (3) các protease; (4) các cơ chế khác như tự tách (self-release) của POL hoặc tách qua trung gian (mediated release) TOP1 hiện còn chưa được rõ.

        2) Tổng hợp chuỗi âm và chuỗi dương: Sau khi loại bỏ POL, chuỗi âm được sửa chữa thêm bằng cách: (1) loại bỏ đoạn DNA dư thừa đầu tận nhờ enzyme nuclease FEN-1 hoặc các nuclease khác và (2) được nối lại nhờ ligase LIG1 hoặc LIG3.

         Chuỗi dương được tổng hợp bằng cách: (1) hoàn thành quá trình tổng hợp DNA bởi các enzyme DNA polymerase của vật chủ khác nhau; (2) loại bỏ và thay thế đoạn mồi RNA nhờ enzyme FEN-1 nuclease; và (3) được nối lại nhờ các ligase LIG1 và LIG3.

        3) Hình thành tiểu nhiễm sắc thể cccDNA (cccDNA minichromosome): cccDNA được nhiễm sắc thể hóa (chromatinization) với các chất như histone, các chất tái tạo chất nhiễm sắc (chromatin remodelers), các yếu tố phiên mã (transcription factors) và các protein của virus để tạo thành một cccDNA dưới dạng nhiễm sắc thể nhỏ (cccDNA minichromosome) bền vững trong nhân các tế bào gan bị nhiễm HBV [5, 6, 15] (Hình 3).

Hình 3. Sự hình thành cccDNA minichromosome từ rcDNA của HBV (Martinez MG, 2021 [5]).

3. Các vai trò chức năng của cccDNA

           Các vai trò chức năng của cccDNA có thể gồm:

         1) CccDNA là một trong những thành phần quan trọng nhất của HBV, có thể tồn tại trong các tế bào gan bị nhiễm HBV và có vai trò làm khuôn mẫu (template) cho bộ máy nhân bản (replication) của virus và đóng vai trò chính trong vòng đời của virus. CccDNA được tạo ra từ rcDNA trong nhân tế bào gan, dưới dạng nhiễm sắc thể nhỏ với khoảng 3 đến 50 bản sao trên mỗi tế bào bị nhiễm bệnh, số lượng này giảm đi khi tế bào gan phân chia do sự phân bố cccDNA giữa các tế bào con do các cccDNA không đồng đều.

         2) Sự khuếch đại (amplification) của cccDNA xảy ra trong quá trình quay vòng (recycling) nội bào có thể đóng vai trò quan trọng trong nhiễm HBV giai đoạn đầu.

         3) PgRNA được tạo ra từ cccDNA cũng có thể được phiên mã ngược để tạo thành rcDNA để nhân bản virus. Chức năng cccDNA được điều hòa một cách mạnh mẽ bởi protein HBx và việc ức chế protein HBx sẽ làm giảm khả năng phiên mã của HBV.

         4) CccDNA cũng đóng một vai trò trong việc nhiễm HBV dai dẳng (persistent) hoặc tái phát (relapse) viêm gan sau khi ngừng điều trị bằng các thuốc kháng virus vì cccDNA rất bền vững trong tế bào gan người không phân chia. Hơn nữa, cccDNA có thể tồn tại trong toàn bộ vòng đời của tế bào gan, do đó nó tác động như một ổ chứa (reservoir) virus dai dẳng.

         5) Sự dai dẳng kéo dài (long-lasting persistence) của HBV cccDNA trong gan cũng đóng một vai trò chủ yếu trong nhiễm HBV tiềm ẩn (occult HBV infection: OBI), là tình trạng thái HBV DNA có thể phát hiện được hoặc không thể phát hiện được trong huyết thanh của những người xét nghiệm âm tính với HBsAg. Trong giai đoạn nhiễm HBV đặc biệt này, cccDNA ở trạng thái nhân bản (replication) thấp. Trạng thái tiềm ẩn này của HBV là kết quả của sự bất hoạt biểu sinh (epigenetic inactivation) của cccDNA [1, 2, 7].

4. Các thuốc điều trị mới nhằm loại trừ HBV cccDNA

           Vì cccDNA của HBV chịu trách nhiệm về sự tồn tại dai dẳng của virus, nên việc loại bỏ, phân hủy hoặc ức chế cccDNA chính là chìa khóa để loại trừ HBV. Các NAs ức chế enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) của pgRNA nhưng không tác động lên cccDNA nên sự mất HBsAg khó xảy ra và sự chữa khỏi tiệt trùng (sterization cure), nghĩa là việc loại bỏ hoàn toàn cccDNA và DNA tích hợp, hiếm khi đạt được. Sự chữa khỏi chức năng (functional cure) được định nghĩa là sự mất HBsAg với sự có hoặc không có chuyển đổi huyết thanh của kháng thể chống lại HBsAg là anti-HBs, hoạt độ ALT bình thường và HBV DNA không thể phát hiện được trong huyết thanh. Việc mất hoặc mất một phần cccDNA có thể đạt được thông qua các cơ chế khác nhau. Tuy nhiên, sự loại trừ cccDNA của HBV như một dấu hiệu đặc trưng của sự chữa khỏi chức năng ở gan bị nhiễm HBV mạn cũng rất khó đạt được [16].

            Các thuốc điều trị mới nhằm loại trừ HBV cccDNA có thể gồm: Các thuốc loại bỏ cccDNA bằng cách chỉnh sửa gen (gene editing); ngăn chặn sự tích lũy cccDNA (prevention of cccDNA accumulation) bằng cách khóa các yếu tố vật chủ liên quan đến sự hình thành cccDNA; làm im lặng (silencing) sự phiên mã cccDNA bằng cách nhắm đích vào sự điều hòa biểu sinh (epigenetic regulation); điều biến sự lắp ráp nucleocapsid (nucleocapsid assembly modulators) bằng cách ngăn chặn tái nhập (reimport) của nucleocapsid mới được tổng hợp, ngăn chặn sự hình thành cccDNA và một số protein có thể đóng một vai trò trong cấu trúc cccDNA, và thanh thải qua trung gian miễn dịch (immune-mediated clearance) các tế bào gan chứa cccDNA hoặc có biểu hiện cccDNA [4, 10, 12].

            Các thuốc điều trị mới nhắm đích vào cccDNA của virus và một số đích phân tử trong vòng đời của HBV được thể hiện ở Hình 4.

Hình 4. Các đích và cơ chế tác động của các thuốc nhắm đích vào cccDNA của virus trong vòng đời của HBV (Ligat G, 2020 [10]). Các thuốc tác dụng trực tiếp vào cccDNA màu đỏ, các thuốc tác dụng gián tiếp vào cccDNA màu xanh lá cây.

    4.1. Các thuốc phân hủy cccDNA bằng cách chỉnh sửa bộ gen

          Các thuốc chống cccDNA trực tiếp nhất là phân hủy nó bằng kỹ thuật chỉnh sửa bộ gen (genome editing). Các hệ thống chỉnh sửa bộ gen chính gồm:

         4.1.1. CRISPR/Cas9: Hệ thống liên quan đến các lặp lại của palindromic ngắn xen kẽ theo cụm/liên kết với Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated system). CRISPR/Cas9 là một loại thuốc chỉnh sửa gen (gene editing), có khả năng làm gián đoạn sự hình thành cccDNA, hiện đang đươc thử nghiệm in vivo và tiền lâm sàng. Kết quả cho thấy thuốc có khả năng cải thiện đáng kể tỷ lệ sống sót của tế bào gan người ở chuột FRG được nhân bản hóa ở gan và làm giảm HBV-DNA toàn phần và cccDNA của gan [8].

         4.1.2. Các nuclease hiệu ứng giống như bộ kích hoạt phiên mã (transcription activator-like effector nucleases: TALENs). Các TALENs nuclease là các enzyme giới hạn (restriction enzymes), được thiết kế để cắt các trình tự DNA cụ thể. Các enzyme TALENs nuclease giới hạn được thiết kế, đưa vào tế bào sử dụng để chỉnh sửa bộ gen. Nghiên cứu tiền lâm sàng bước đầu cho thấy  sau khi tiêm TALEN, nồng độ HBsAg, HBV DNA và RNA trong huyết thanh bệnh nhân giảm liên tục, trong khi sự methyl hóa HBV DNA tăng dần.        

         4.1.3. Nuclease ngón tay kẽm (zinc finger nuclease: ZFN). Nuclease ngón tay kẽm (ZFN) là một loại thuốc chỉnh sửa bộ gen, có tác dụng phá vỡ cccDNA, ngăn chặn một cách có hiệu quả khuôn mẫu tế bào đối với sự dai dẳng của HBV và ức chế sự nhân bản của HBV hoạt động, hiện đang được nghiên cứu in vitro và thử nghiệm tiền lâm sàng [8].

        Tất cả các thuốc chỉnh sửa bộ gen này có tác dụng phá vỡ chuỗi kép của DNA tại một vị trí đích đặc biệt và sửa chữa các vị trí phân cắt bằng cách làm thay đổi trình tự DNA, trong số các thuốc này, hệ thống CRISPR/Cas9 là thuốc có triển vọng nhất [10].

    4.2. Các thuốc ức chế sự hình thành cccDNA bằng cách khóa các yếu tố vật chủ liên quan

        Thay vì nhắm đích trực tiếp vào cccDNA, một cách tiếp cận khác là nhắm đích các yếu tố vật chủ (host factors) vốn có vai trò trong hình thành hoặc duy trì cccDNA. Các yếu tố tế bào chủ tham gia vào bộ máy sửa chữa DNA có thể đóng vai trò chính trong quá trình biến rcDNA thành cccDNA trong quá trình hình thành cccDNA, có thể trở thành các đích đầy hứa hẹn cho sự phát triển của các loại thuốc kháng virus mới để chữa khỏi HBV. Các thuốc ức chế sự hình thành cccDNA bằng cách khóa các yếu tố vật chủ liên quan có thể gồm:

        4.2.1. Các thuốc ức chế Tyrosyl-DNA-phosphodiesterase 2 (TDP2). TDP2 là một enzyme quan trọng để giải phóng polymerase (POL) từ rcDNA của HBV.

        4.2.2. Các thuốc ức chế DNA polymerase K (POLK). DNA polymerase là một DNA polymerase họ gamma, là nhân tố chính trong việc hoàn thành chuỗi dương trong quá trình chuyển đổi rcDNA thành cccDNA.

        4.2.3. Các thuốc ức chế yếu tố xử lý tiền mRNA của tế bào 31 (PRPF31). PRPF31 đã được chứng minh là có liên quan đến việc hình thành hoặc duy trì cccDNA. PRPF31 tương tác với HBx trong nhân giúp tăng cường sự hình thành cccDNA.

            Điều cần chú ý là, do các yếu tố đích của vật chủ của HBV cũng tham gia vào quá trình điều hòa gen của vật chủ nên các thuốc khóa các yếu tố vật chủ có thể có các tác dụng phụ đối với cơ thể cần được đánh giá cẩn thận.

   4.3. Các thuốc làm im lặng sự phiên mã cccDNA bằng cách điều biến biểu sinh

             Một cách tiếp cận trị liệu khác là làm gián đoạn chức năng của cccDNA bằng cách làm im lặng (silencing) quá trình phiên mã (transcription) của cccDNA thông qua sự điều biến các thay đổi biểu sinh (epigenetic) ảnh hưởng đến sự hình thành cccDNA và kiểm soát quá trình phiên mã của nó. Những thay đổi biểu sinh có thể là sự acetyl hóa histone, methyl hóa DNA, methyl hóa m6A có thể là đích của các interferon (IFN). Các thuốc làm im lặng sự phiên mã cccDNA bằng cách điều biến biểu sinh có thể gồm:

           4.3.1. Các interferon (IFN). Các cccDNA được tổ chức dưới dạng một nhiễm sắc thể nhỏ (minichromosome) với sự tham gia của các protein histone và phi histone, có các vị trí gắn các yếu tố phiên mã khác nhau. Các protein của virus như HBx và HBc cũng có thể tham gia vào hoạt động của cccDNA. Protein điều hòa HBx của virus cần thiết cho quá trình phiên mã HBV của cccDNA. Các thuốc interferon tham gia vào điều biến biểu sinh HBV cccDNA có thể gồm:

          1) Interferon-α (IFN-α). IFN-α có tác dụng làm giảm quá trình phiên mã của cccDNA thành các RNA virus bằng cách làm giảm quá trình acetyl hóa histone gắn cccDNA.

          2) Interleukin-6 (IL-6). IL-6 có tác dụng ức chế sự sao chép của HBV bằng cách làm giảm sự acetyl hóa histone gắn với cccDNA và sự biểu hiện của HNF4 [10].

          4.3.2. Các thuốc làm thay đổi histone acetyl hóa và methyl hóa H3 và H4. Các thuốc này gắn vào HBV cccDNA và tác động đến quá trình phiên mã của cccDNA. Sự tăng acetyl hóa các histone H3 và H4 gắn cccDNA có thể làm tăng sự sao chép HBV, trong khi sự giảm acetyl hóa các histone H3 và H4 gắn cccDNA làm giảm sự sao chép HBV ở các bệnh nhân nhiễm HBV.

          4.3.3. Các RNA không mã hóa (non-coding RNA). Các RNA không mã hóa như các microRNA (miRNA) có thể nhắm đích và làm giảm sự sao chép của HBV bằng cách liên kết với HBV mRNA hoặc bằng cách nhắm đích vào các yếu tố vật chủ [10].

         1) Các microRNA-1 không mã hóa (miR-1). MiR-1 có khả năng làm tăng quá trình phiên mã HBV bằng cách nhắm đích vào các yếu tố phiên mã HDAC4 và E2F 5.

         2) Các RNA dài không mã hóa (long non-coding RNA: lncRNA). Các lncRNA như PCNAP1 có khả năng thúc đẩy quá trình sao chép HBV và tích lũy cccDNA bằng cách điều chỉnh con đường miR-154/PCNA/HBV cccDNA.

         4.3.4. Các RNA can thiệp (RNA interference: RNAi) và các oligonucleotides đối mã (antisense oligonucleotides: AONs). Các RNAi có khả năng làm im lặng sự phiên mã cccDNA bằng cách điều biến biểu sinh gồm:

        1) ARC-520. ARC-520 là một mRNA can thiệp, có khả năng ức chế sự phiên mã, được sử dụng bằng cách tiêm tĩnh mạch, đang được thử nghiệm giai đoạn II, có khả năng làm giảm HBsAg đáng kể và tồn tại >85 ngày sau liều cuối cùng.

        2) GSK3389404. GSK3389404 là một mRNA can thiệp, có khả năng ức chế sự phiên mã, được sử dụng bằng cách tiêm dưới da, đang được thử nghiệm giai đoạn I. Liều 120 mg được sử dụng trong 4 tuần an toàn và có khả năng dung nạp tốt [8].

   4.4. Các thuốc điều biến sự lắp ráp lõi nhân

         Các thuốc điều biến lắp ráp lõi (capsid assembly modulators: CAMs) đã được phát triển để làm gián đoạn (disrupt) các vai trò chức năng của protein lõi HBc, ngăn chặn sự hình thành lõi nhân (nucleocapsid) chứa cccDNA. Các thuốc CAMs có thể tác động đến mức độ cccDNA theo một số cơ chế gồm: 1) ngăn chặn việc tái nhập (reimport) của các nucleocapsid mới được tổng hợp, do đó ngăn chặn sự khuếch đại của các cccDNA; 2) ngăn chặn sự tổng hợp của các cccDNA trong các tế bào mới bị nhiễm và 3) nhắm đích vào chính protein lõi HBc, một protein đóng vai trò trong chủ yếu trong cấu trúc của lõi nhân chứa HBV cccDNA [10].

         Các thuốc điều biến sự lắp ráp lõi nhân (nucleocapsid assembly modulators: CAMs) có thể gồm: 1) JNJ-632 và BAY41-4109; 2) NVR3-778; 3) JNJ-6379; 4) ABI-H0731 [8].

   4.5. Loại bỏ các tế bào gan nhiễm cccDNA qua trung gian miễn dịch

         Đến nay, việc chữa khỏi chức năng chỉ có thể đạt được ở <10% bệnh nhân CHB với các thuốc kháng virus hiện có. Sự dai dẳng của HBV cccDNA cùng với sự rối loạn chức năng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với virus viêm gan B (HBV) được xem là những nguyên nhân chính gây nhiễm HBV mạn. Do đó, sự điều biến hệ thống miễn dịch của vật chủ để tăng cường các đáp ứng miễn dịch tế bào cụ thể có thể giúp loại bỏ HBV. Các phản ứng miễn dịch đặc hiệu với HBV có thể được tạo ra bởi vaccine điều trị, bao gồm các vaccine dựa trên các protein của virus như HBsAg/preS và HBcAg, dựa trên DNA và vaccine dựa trên vector virus [3]. Các thuốc giúp loại bỏ các tế bào gan bị nhiễm cccDNA qua trung gian miễn dịch có thể gồm:

        4.5.1. Vaccine điều trị (therapeutic vaccination). Các chiến lược nhằm cải thiện việc tiêm vaccine điều trị nhiễm virus viêm gan B (HBV) mạn có thể bao gồm:

         1) Tiêm chủng cho những người có tải lượng kháng nguyên HBV thấp hơn hoặc bị giảm tải lượng kháng nguyên do điều trị nucleos(t)ide (NAs), RNA can thiệp nhỏ (siRNA) hoặc polymer của acid nucleic (NAP) trước khi tiêm vaccine;

         2) Làm đảo ngược rối loạn chức năng tế bào T khi điều trị đồng thời với thuốc ức chế điểm kiểm soát miễn dịch;

         3) Tối ưu hóa chất sinh miễn dịch (immunogen) của vaccine bằng các kháng nguyên HBV đa dạng (multiple HBV antigens);

         4) Kết hợp các vaccine cơ bản trong các chiến lược tăng cường vaccine khác loại;

         5) Nhắm đích vào tế bào T theo đường gan, chẳng hạn như tiêm vaccine qua tĩnh mạch [3].

     4.5.2. Các chất ức chế điểm kiểm soát miễn dịch (immune check point inhibitors) như:

          1) Thuốc chống sự chết tế bào theo chương trình-1 (anti-programmed cell death-1: PD-1)

          2) Thuốc chống ligan của sự chết tế bào theo chương trình-1 (anti-programmed cell death-Ligan 1: PDL-1)

          3) Thuốc chống CTLA-4 (anti-CTLA-4). Tuy nhiên, hiệu quả lâm sàng của việc tiêm vaccine điều trị vẫn cần được xác định [10].

          Cho đến nay, các nỗ lực điều trị bằng vaccine HBV đã không hiệu quả trong việc tạo ra khả năng chữa khỏi chức năng một cách đáng tin cậy ở những bệnh nhân nhiễm HBV mạn. Tình trạng giảm đáp ứng tế bào T đặc hiệu với HBV kéo dài và HBsAg định lượng cao của những người tham gia, cùng với khả năng sinh miễn dịch tế bào T hạn chế của chính những vaccine điều trị là những lý do có thể đã cản trở sự thành công của những vaccine điều trị này [3].

          Trong tương lai, việc tối ưu hóa các đáp ứng của tế bào T bằng cách lựa chọn các vector vaccine sinh miễn dịch tối đa (maximally immunogenic vaccine vectors), các con đường tiêm chủng và các yếu tố quyết định kháng nguyên (epitope) bảo vệ miễn dịch, cùng với các thuốc làm giảm rối loạn chức năng tế bào T của HBV như các thuốc ức chế điểm kiểm soát miễn dịch (immune check‐point inhibitors), có thể có tiềm năng thực sự để vượt qua các rào cản kiểm soát miễn dịch do nhiễm HBV mạn gây nên [3].

   5. Những thách thức trong việc loại bỏ cccDNA của HBV.

          Những thách thức trong việc loại bỏ cccDNA của HBV. Những thách thức đối với việc loại bỏ cccDNA của HBV gồm:

           1) Các thuốc kháng virus hiện nay có thể ức chế enzyme nuclease sao chép ngược, ngăn chặn hiệu quả sự nhân lên của virus, đưa HBV DNA về dưới ngưỡng phát hiện, nhưng vì không loại trừ được cccDNA trong nhân tế bào nên vẫn ít có khả năng đưa được HBsAg về âm tính, nghĩa là vẫn chưa thể điều trị khỏi chức năng viêm gan B mạn. Tuy nhiên, việc điều trị hiện nay vẫn có thể giúp làm giảm nguy cơ bệnh gan tiến triển, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn.

           2) Những hiểu biết về sinh học cơ bản của cccDNA để phát triển các loại thuốc giúp loại bỏ cccDNA còn chưa đầy đủ.

           3) Các thuốc mới nhằm loại trừ hoặc làm im lặng cccDNA hiện còn đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I hoặc II.

           4) Hiệu quả của các thuốc mới nhằm loại trừ hoặc làm im lặng cccDNA còn chưa được đánh giá đầy đủ.

           5) Các xét nghiệm về cccDNA và các dấu ấn mới chưa đủ độ nhạy và chuẩn hóa để có thể giúp theo dõi mức độ cccDNA trong gan và đánh giá hoạt động phiên mã của cccDNA nhằm hướng dẫn điều trị và phát triển các thuốc nhắm đích cccDNA mới [6, 13, 14, 16].

          Tóm lại, cccDNA được hình thành từ rcDNA trong nhân tế bào gan bị nhiễm HBV và từ rcDNA lõi mới được tổng hợp dưới dạng dslDNA quay vòng lại nhân. Cơ chế hình thành cccDNA gồm các bước: Tách polymerase, loại bỏ đoạn mồi RNA, tách chuỗi r, sửa chữa chuỗi âm, nối chuỗi âm, hoàn thành DNA chuỗi dương và hình thành cccDNA. Các vai trò chức năng của cccDNA gồm: CccDNA tác động như một khuôn mẫu để phiên mã tất cả các RNA của virus; cccDNA hình thành trong quay vòng nội bào có thể có vai trò trong giai đoạn đầu nhiễm HBV; pgRNA tạo ra từ cccDNA được phiên mã ngược tạo thành rcDNA để nhân bản virus; cccDNA cũng đóng vai trò trong nhiễm HBV dai dẳng hoặc tái phát vì nó rất bền vững; sự dai dẳng của cccDNA cũng có vai trò trong nhiễm HBV ẩn (OBI). Các thuốc điều trị mới đối với cccDNA gồm: Các thuốc loại bỏ cccDNA bằng chỉnh sửa gen, ngăn chặn hình thành cccDNA bằng khóa các yếu tố vật chủ, làm im lặng sự phiên mã cccDNA bằng điều biến biểu sinh và bằng đào thải qua trung gian miễn dịch các tế bào gan có cccDNA. Những thách thức đối với việc chữa khỏi chức năng viêm gan B mạn gồm: Sự dai dẳng của cccDNA, không chịu tác động của các thuốc hiện nay là thách thức chủ yếu cần đạt được để chữa khỏi HBV; sự hiểu biết về sinh học của cccDNA nhằm phát triển các thuốc loại bỏ cccDNA còn chưa đầy đủ; các loại thuốc mới nhằm loại bỏ hoặc làm im lặng cccDNA hiện đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I hoặc II; hiệu quả của các thuốc kháng cccDNA mới chưa được đánh giá đầy đủ; và các xét nghiệm về cccDNA hiện chưa đủ độ nhạy và tiêu chuẩn hóa để hướng dẫn điều trị nhằm loại bỏ cccDNA.

Tài liệu tham khảo

1. Allweiss L and Dandri M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses 2017 Jun; 9(6): 156.
2. Bianca C, Sidhartha E, Tiribelli C, El-Khobar KE, and Sukowati CHC. Role of hepatitis B virus in development of hepatocellular carcinoma: Focus on covalently closed circular DNA. World J Hepatol 2022 May 27; 14(5): 866-884.
3. Cargill T and Barnes E. Therapeutic vaccination for treatment of chronic hepatitis B. Clin Exp Immunol 2021 Aug; 205(2): 106-118.
4. Dandri M and Petersen J. cccDNA Maintenance in Chronic Hepatitis B - Targeting the Matrix of Viral Replication. Infect Drug Resist 2020; 13: 3873-3886.
5. Ghosh S, Chakraborty A, and Banerjee S. Persistence of Hepatitis B Virus Infection: A Multi-Faceted Player for Hepatocarcinogenesis. Front Microbiol 2021; 12: 678537.
6. Hu J, Protzer U, and Siddiqui A. Revisiting Hepatitis B Virus: Challenges of Curative Therapies. J Virol 2019 Oct 15; 93(20): e1032-1019.
7. Hu JL and Huang AL. Dynamics of Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA: A Mini-Review. Microorganisms 2023; 11(3): 600.
8. Leowattana W and Leowattana L. Chronic hepatitis B: New potential therapeutic drugs target. World J Virol 2022 Jan 25; 11(1): 57-72.
9. Li X, Zhao J, Yuan Q, and Xia N. Detection of HBV Covalently Closed Circular DNA. Viruses 2017 Jun; 9(6): 139.
10. Ligat G, Goto K, Verrier E and Baumert TF. Targeting Viral cccDNA for Cure of Chronic Hepatitis B. Curr Hepatol Rep 2020 Sep; 19(3): 235-244.
11. Lok ASF. Hepatitis B treatment: What we know now and what remains to be researched. Hepatol Commun 2018; 3: 8-19.
12. Martinez MG, Boyd A, Combe E, Testoni B, Zoulim F. Covalently closed circular DNA: The ultimate therapeutic target for curing HBV infections. J Hepatol 2021 Sep; 75(3): 706-717.
13. Moini M and Fung S. HBsAg Loss as a Treatment Endpoint for Chronic HBV Infection: HBV Cure. Viruses 2022 Apr; 14(4): 657.
14. Nassal M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut 2015 Dec; 64(12): 1972-1984.
15. Wei L and Ploss A. Mechanism of Hepatitis B Virus cccDNA Formation. Viruses 2021 Aug; 13(8): 1463.
16. Xia Y and Guo H. Hepatitis B Virus cccDNA: Formation, Regulation and Therapeutic Potential. Antiviral Res 2020 Aug; 180: 104824.