Giá trị của các xét nghiệm Real-time RT-PCR kháng nguyên NS1 kháng thể IgM và IgG trong chẩn đoán sớm nhiễm virus sốt Dengue

PGS TS Nguyễn Nghiêm Luật - Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC

Tóm tắt

1. Sốt Dengue có thể bùng phát thành dịch và gây tử vong ở trẻ em hoặc người lớn. Tỷ lệ tử vong do các biến chứng của sốt xuất huyết Dengue cao đến 20% nhưng nếu được phát hiện sớm và quản lý đúng cách, tỷ lệ này sẽ giảm xuống dưới 1%.

2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kháng nguyên Dengue NS1 tương ứng là 89,9% và 100%. Kháng nguyên Dengue có giá trị để chẩn đoán sớm, sàng lọc và giới hạn dịch lan rộng.

3. Kháng thể Dengue IgM là loại kháng thể đầu tiên xuất hiện, có thể phát hiện ở khoảng 50% số bệnh nhân sốt từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 5, sau đó tăng chậm dần.

4. Kháng thể Dengue IgG thường được phát hiện ở cuối tuần thứ nhất của sốt, sau đó tăng chậm và còn có thể phát hiện sau vài tháng hoặc cả đời.

5.  Real-time RT-PCR được xem như “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán sớm nhiễm virus Dengue và để xác định các type huyết thanh của virus này.

Value of the tests Real-time RT-PCR, antigen NS1, immunoglobulins IgM and IgG in early diagnosis of Denfue fever infection.

                                                  Luat NN, MEDLATEC General Hospital

Abstract

1. Dengue fever may cause the significant morbidity and mortality in children or adults. The mortality from the complications of Dengue hemorrhagic fever is high as 20%, whereas if recornized early and managed properly, mortality is less than 1%.

3. The sensitivity and specificity of Dengue NS1 antigen were found to be 89.9 and 100%, respectively. Dengue NS1 antigen has potential value for use in early diagnosis, screening and limit dengue expansion.

4. Dengue IgM antibodies are the first immunoglobulin isotype to appear, may be detectable in 50% patients by days 3-5 of the fever, after that inceasing slowly.

5. Dengue IgG antibodies are generally detectable at the end of the first week of the fever, inceasing slowly thereafter and still detectable after several months or even for life.

6. Real-time RT-PCR was found to be a “gold standard” for early diagnosis of dengue virus infection and for serotyping the virus.

Sốt Dengue (Dengue fever: DF), sốt xuất huyết Dengue (Dengue hemorrhagic fever: DHF) và dạng nặng nề nhất của bệnh là Hội chứng sốc Dengue (Dengue Shock Syndrome) đều do một trong bốn loại virus thuộc chi Flavivirus, có bản chất RNA, nhưng khác nhau về mặt kháng nguyên là DEN-1, DEN-2, DEN-3 và DEN-4 gây nên. Sốt Dengue là một bệnh virus do muỗi vằn Aedes aegypti lây truyền cho người. Nhiễm một type virus Dengue có khả năng tạo nên miễn dịch suốt đời nhưng chỉ chống lại được chính type virus đó. Vì vậy, một người có thể mắc bệnh nhiều lần trong đời.

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 2012) hiện có khoảng 2,5 đến 3 tỷ người (xấp xỉ 40% dân số thế giới) ở 112 nước vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới có nguy cơ nhiễm Dengue. Mỗi năm trên thế giới có  khoảng 50 - 100 triệu ca sốt dengue, trong đó có khoảng 500.000  ca sốt xuất huyết Dengue, với khoảng 24.000 ca tử vong (chủ yếu là trẻ em).

Sốt xuất huyết Dengue được phân biệt với sốt dengue bởi có sự thoát huyết tương, giảm tiểu cầu nặng và xuất huyết phủ tạng. Việc thoát huyết tương nặng có thể dẫn đến sốc (shock) với tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhân không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời là khoảng 10-20%, có thể lên đến 40% nếu có shock. Tuy nhiên, nếu bệnh nhân được quản lý, điều trị và chăm sóc tại bệnh viện, tỷ lệ tử vong sẽ giảm xuống chỉ còn dưới 1%.

Việc chẩn đoán sớm sốt Dengue hiện đang là một thách thức bởi vì các triệu chứng lâm sàng của nó rất giống với các sốt do virus khác. Các biến chứng chủ yếu của sốt Dengue là: viêm gan, viêm não, viêm cầu thận và rối loạn chức năng tim, thường xuất hiện từ 3-7 ngày nhiễm virs Dengue.

Để chẩn đoán chính xác sốt Dengue không thể chỉ dựa vào các biểu hiện lâm sàng. Gần đây, các xét nghiệm kháng nguyên Dengue NS1 (NS1 antigen: non-structural 1 antigen), kháng thể Dengue IgM và Dengue IgG và real-time RT-PCR đã được sử dụng rộng rãi.

1.  Những thay đổi về lâm sàng, huyết học, virus và miễn dịch trong quá trình nhiễm virus sốt Dengue

Những thay đổi về lâm sàng, huyết học, virus và miễn dịch trong quá trình nhiễm virus sốt Dengue được tóm tắt ở Hình 1.

Hình 1. Những thay đổi về lâm sàng, huyết học, virus và miễn dịch trong quá trình nhiễm virus sốt Dengue (WHO 2012).

Những thay đổi về số lượng virus (RT-PCR hoặc Real-time RT-PCR) và miễn dịch (mức độ kháng nguyên NS1, các kháng thể IgM và IgG) trong quá trình nhiễm virus Dengue nguyên phát và thứ phát được thể hiện ở Hình 2.

Hình 2. Sự thay đổi về số lượng virus, mức độ Kháng nguyên NS1, các kháng thể IgM và IgG trong quá trình nhiễm virus Dengue nguyên phát và thứ phát.

2. Những phương pháp xác định virus và miễn dịch trong sốt Dengue

 2.1. Xác định kháng nguyên Dengue NS1:

Có nhiều phương pháp xác định kháng nguyên Dengue NS1 khác nhau, mỗi phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau. Đó là các phương pháp: test nhanh NS1 antigen sử dụng sắc ký miễn dịch (immunochromatography), hấp phụ miễn dịch gắn enzyme ELISA (enzyme-linked immunosorbent) hoặc kết hợp xác định kháng nguyên Dengue NS1 và các kháng thể Dengue IgM và IgG Dengue.

2.2. Xác định kháng thể Dengue IgM:

Kháng thể Dengue IgM có thể được phát hiện bằng kit µ-capture Dengue IgM ELISA kit. Mật độ quang (OD) được đo ở bước sóng 450 nm sử dụng ELISA reader (BioTekR).

2.3. Xác định kháng thể Dengue IgG:

Kháng thể Dengue IgM có thể được phát hiện bằng test nhanh sắc ký miễn dịch (rapid immunochromatographic test).

2.4. Xác định sự có mặt của virus Dengue và các type Dengue bằng Real-time RT-PCR:

Việc phát hiện DENV RNA (RNA của virus Dengue) được thực hiện bằng cách chiết xuất RNA của virus Dengue bằng kit (viral RNA extraction kit), sau đó xác định các type DENV serotype bằng real-time RT-PCR đặc hiệu type huyết thanh (serotype-specific RT-PCR).

Do các kháng thể IgM và IgG xuất hiện chậm nên Real-time RT-PCR, cùng với kháng nguyên NS1, trở nên phương tiện rất hữu ích trong việc phát hiện sớm nhiễm virus Dangue.

3. Ý nghĩa lâm sàng của các xét nghiệm Dengue NS1, IgM, IgG và RT-PCR      

3.1. Giá trị của các xét nghiệm Dengue NS1 trong phát hiện sớm sốt Dengue

Giá trị của các xét nghiệm Dengue NS1, IgM và IgG trong phát hiện sớm sốt Dengue đã được nhiều tác giả công bố (Wang SM, 2010 [7], Shah KD và cộng sự 2015 [6]).

Trong một nghiên cứu mới nhất trên 200 bệnh nhân nghi bị sốt Dengue, Gaikwad S và cộng sự, 2017 [3] thấy rằng khi sử dụng “tiêu chuẩn vàng” (gold standard) Real-time RT-PCR, độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự đoán (+) tính và dự đoán (-) tính của test kháng nguyên Dengue NS1 nhanh tương ứng là 81,5%, 66,7%, 78,2% và 71,1% (Bảng 1). Độ phù hợp giữa Dengue NS1 test nhanh và real-time RT-PCR là 75,5%, tối đa là 80% từ ngày 2 đến 5.

Bảng 1. Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị chẩn đoán (+) tính, giá trị chẩn đoán (-) tính và độ phù hợp của NS1 test nhanh sử dụng “tiêu chuẩn vàng” Real-time RT-PCR (Gaikwad S, 2017) [3].

Các giá trị này khi được xác định bằng ELISA có các giá trị tương ứng là 89,9%, 100%, 100% và 87,1% (Bảng 2). Độ phù hợp giữa Dengue NS1 ELISA và real-time RT-PCR là 94%, tối đa là 100% từ ngày 3 đến 8 (Bảng 2).

Bảng 2. Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị chẩn đoán (+) tính, giá trị chẩn đoán (-) tính và độ phù hợp của NS1 ELISA sử dụng “tiêu chuẩn vàng” Real-time RT-PCR (Gaikwad S, 2017) [3].

Các tác giả cũng thấy rằng có sự khác nhau về mức độ phù hợp giữa giữa các kết quả kháng nguyên NS1 test nhanh và kháng nguyên NS1 ELISA ở những ngày sốt khác nhau (Bảng 3). Độ phù hợp tối đa ở ngày sốt thứ 2 là 89,1% và ở các ngày sốt thứ 3-5 là khoảng 80% (Bảng 3).

Bảng 3. Độ phù hợp giữa các kết quả kháng nguyên NS1 test nhanh và kháng nguyên NS1 ELISA ở những ngày sốt khác nhau (Gaikwad S, 2017) [3].

           
Như vậy, kháng nguyên NS1 xác định bằng ELISA có thể được sử dụng để chẩn đoán Dengue trong giai đoạn sớm, trong sàng lọc Dengue ở vùng đang có dịch và góp phần làm giảm sự lây lan bệnh. Kháng nguyên NS1 và real-time TR-PCR thật sự có giá trị trong chẩn đoán nhanh và sớm sốt Dengue (Ahmed NH, 2014 [1], Anand AM, 2016 [2], Gaikwad S, 2017 [4]).

3.2. Giá trị của các xét nghiệm Dengue IgM trong chẩn đoán sốt Dengue.

Trong nhiễm Dengue tiên phát, kháng thể IgM xuất hiện chậm, chỉ có thể phát hiện trong máu ở 80% số bệnh nhân ở ngày thứ 5 và 93-99% số bệnh nhân ở ngày thứ 6 đến ngày thứ 10 kể từ khi xuất hiện sốt. Dangue IgM có thể tồn tại trong máu đến trên 90 ngày. Trong một nghiên cứu trên 100 bệnh nhân sốt đến ngày thứ 7, Shah KD và cộng sự, 2015 [6] thấy rằng Dengue IgM chỉ (+) tính 27%, IgM (+) tính + NS1 hoặc IgG (+) tính 26% và IgM (-) tính 47% (Bảng 4).

Bảng 4. Đặc điểm kháng thể IgM ở các bệnh nhân  sốt Dengue  (n=100) (Shah KD, 2015 [6].

 3.3. Giá trị của các xét nghiệm Dengue IgG trong chẩn đoán sốt Dengue.

Trong sốt xuất huyết nguyên phát, kháng thể Dengue IgG chưa xuất hiện trong giai đoạn cấp tính và chỉ xuất hiện trong giai đoạn hồi phục. Trong sốt xuất huyết thứ phát, kháng thể Dengue IgG xuất hiện ngay trong giai đoạn cấp tính và tăng trên 4 lần trong giai đoạn hồi phục (nếu các mẫu máu lấy cách nhau ít nhất 7 ngày). Shah KD và cộng sự, 2015 [6] nghiên cứu trên 143 bệnh nhân sốt đến ngày thứ 7, thấy rằng IgG không (+) tính, IgG (+) tính + NS1 hoặc IgG (+) tính chỉ 15% và IgG (-) tính 85% (Bảng 5).

Bảng 5. Đặc điểm kháng thể IgG ở các trẻ sốt Dengue  (n=100) (Shah KD, 2015 [6]).

3.5. Giá trị của xét nghiệm Real-time RT-PCR trong chẩn đoán sớm sốt Dengue.

Kỹ thuật sinh học phân tử Real-time RT-PCR có thể thể phát hiện virus Dengue trong máu ngay từ ngày đầu tiên đến ngày thứ 5 kể từ khi xuất hiện sốt.

Moi ML và cộng sự (2013) [3] nghiên cứu trên 336 người bị nhiễm dengue, tỷ lệ NS1 (+) tính là 301 (90%), trong khi ở 148 người không bị nhiễm dengue, NS1 đều (-) tính. Trong số 336 mẫu, 223 (66%) mẫu (+) tính với cả NS1 xác định bằng ELISA và RNA virus bằng RT-PCR. Có 78 (23%) mẫu (+) tính với NS1 nhưng (-) tính với RT-PCR, 3 (1%) mẫu (-) tính với NS1 nhưng (+) tính với RT-PCR và 32 (9,5%) mẫu (-) tính với cả NS1 và RT-PCR.

Trong một nghiên cứu trên 321 bệnh nhân nghi ngờ bị sốt dengue, Pok KY và cộng sự, 2010 [4], đã nghiên cứu đồng thời cả 4 thông số về sốt dengue và đã phát hiện ra rằng trong 3 ngày đấu của sốt, RT-PCR có độ nhạy là 100%, trong khi đó, độ nhạy của kháng nguyên NS1 là 82,7%, còng kháng thể IgM là 17,3% và IgG là 11,5%. Sau đó độ nhạy của RT-PCR và kháng nguyên NS1 giảm dần trong khi độ nhạy của các kháng thể IgM và IgG tăng dần (Bảng 6).

   Bảng 6. Độ nhạy của các phương pháp chẩn đoán sốt Dengue theo ngày sốt (Pok KY, 2010 [4]).

       
Do các kháng thể IgM và IgG xuất hiện chậm nên xét nghiệm Real-time RT-PCR, cùng với kháng nguyên NS1, trở nên phương tiện rất hữu ích trong việc phát hiện nhiễm virus Dengue sớm.

                        Tài liệu tham khảo

1.   Ahmed NH, and Broor S. Comparition of NS1 antigen detection ELISA, real time RT-PCR and virus isolation for rapid diagnosis of dengue infection in acute phase. J Vector Borne Dis 2014; 51: 194-199.

2.   Anand AM, Sistla S, Dhodapkar R, et al. Evaluation of NS1 Antigen Detection for Early Diagnosis of Dengue in a Tertiary Hospital in Southern India. J Clin Diagn Res 2016 Apr; 10(4): DC01-DC04.

3.   Gaikwad S, Sawant SS, and Shatri JS. Comparison of nonstructural protein-1 antigen detection by rapid and enzyme-linked immunosorbent assay test and its correlation with polymerase chain reaction for early diagnosis of dengue. J Lab Physicians 2017 Jul-Sep; 9(3): 177-181.

4.   Moi ML, Omatsu T, Tajima S, et al. Detection of dengue virus nonstructural protein 1 (NS1) by using ELISA as a useful laboratory diagnostic method for dengue virus infection of international travelers. J Travel Med 2013 May-Jun; 20(3): 185-193.

5.   Pok KY, Lai YL, Sng J, and Ng LC. Evaluation of Nonstructural 1 Antigen Assays for the Diagnosis and Surveillance of Dengue in Singapore. Vector-Borne and Zoonotic Diseases 2010; 10(1): 1009-1016.

6.   Shah KD, Chithambaram NS, Katwe N. Effectiveness of serological tests for early detection of dengue fever. Sch J App Med Sci 2015; 3(1D): 291-296.

7. Wang SM, and Sekaran SD. Early Diagnosis of Dengue Infection Using a Commercial Dengue Dudo Rapid Test Kit for the Detection of NS1, IgM, and IgG. Am J Trop Med Hyg 2010; 83(3): 690-695.